Cambios citomorfométricos en células de la mucosa oral de pacientes con diabetes mellitus tipo 2. Evaluación de su utilidad diagnóstica

Cornejo A, Roa I. Cambios citomorfométricos en células de la mucosa oral de pacientes con Diabetes Mellitus Tipo 2. Evaluación de su utilidad diagnóstica. Mouth. 2016;1(1):e21092016es. DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.154597.
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Andrés Cornejo.
Departamento de Ciencias Básicas Biomédicas, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Talca (UTALCA), Talca, Chile.

Ignacio Roa ORCID iD logo 16x16 orcid.org/0000-0001-6493-6703
Departamento de Ciencias Básicas Biomédicas, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Talca (UTALCA), Talca, Chile. Programa de Doctorado en Morfología, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera (UFRO), Temuco, Chile.
Correspondencia: iroa{at}utalca.cl


Resumen


La citología exfoliativa ha mostrado previamente cambios citomorfométricos en descamados celulares orales en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (DB2). El objetivo de esta investigación fue determinar la capacidad de identificar la presencia de DB2 a partir de estos cambios. Mediante citología exfoliativa oral de pacientes diabéticos (n=30) y controles (n=30) se obtuvieron (en dos registros, con intervalo de un mes) los valores de diámetro nuclear (DN), diámetro citoplasmático (DC), proporción núcleo:citoplasma (RNC) y presencia/ausencia de cariorrexis y binucleación. Además se registraron los valores de glicemia capilar y hemoglobina glicosilada (Hb1Ac). El grupo DB2 mostró un aumento estadísticamente significativo del DN y RNC (valor p<0,05, Test t de Student) en comparación con los pacientes sin diabetes. También se observó una asociación entre cariorrexis y binucleación (valor p<0,005, Test exacto de Fisher) con DB2. El modelo de regresión logística binaria, que incluyó las variables DN y DC, explicó pobremente la varianza del diagnóstico, con una especificidad y sensibilidad moderada para la clasificación de los pacientes con DB2. Las células de la mucosa oral de pacientes con DB2 presentan un mayor diámetro nuclear y RNC, correlacionándose con los valores de glicemia, sin embargo no es posible clasificar a partir de estos análisis si los pacientes poseen DB2.

Palabras clave:  diabetes mellitus tipo 2; técnicas citológicas; mucosa oral.

Introducción


Se estima que aproximadamente 175 millones de personas ignoran que padecen de diabetes mellitus tipo 2, cifra que resulta preocupante, considerando que mientras antes sea diagnosticada y comience el tratamiento mayor será la oportunidad de prevenir o reducir complicaciones y costos de esta enfermedad [1]. Previamente, varios estudios han demostrado mediante citología exfoliativa una asociación significativa entre los cambios citomorfométricos en células de la mucosa oral de pacientes diabéticos y los distintos niveles de glicemia [2][3][4][5]. Estos cambios pueden ser cuantitativos, como el aumento del área nuclear y la disminución de la proporción núcleo-citoplasma [2][4] y también cualitativos, incluyendo la presencia de cariorrexis, bi-tri nucleación, vacuolas nucleares, gránulos eosinofílicos y halos perinucleares, entre otros [3][6]. Pese a la evidencia, los estudios no han establecido si la citología exfoliativa es capaz de discriminar entre pacientes diabéticos y no diabéticos, por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue determinar si la citología exfoliativa oral puede servir como una potencial herramienta diagnóstica y de control para la diabetes mellitus tipo 2.

Materiales y métodos


Se realizó un estudio observacional de tipo prospectivo. Los protocolos fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad de Talca (2014-071-IR).

Cálculo de tamaño de la muestra

Se estimó el tamaño muestral para dos grupos independientes, mediante la calculadora GRANMO del Institut Municipal d’InvestigacióMèdica, Barcelona, España (http://www.imim.es/ofertadeserveis/software-public/granmo/). Se consideró un tipo de contraste unilateral, error alfa de 5% y beta de 20%, una razón entre los sujetos de ambos grupos de 1 (equilibrados), una desviación estándar común de 17; una diferencia biológicamente significativa para los cambios citomorfométricos de 12 µm y una pérdida de seguimiento del 16% de los sujetos. Se precisaron 30 sujetos en el primer grupo y 30 en el segundo para detectar una diferencia igual o superior a 12 unidades.

Sujetos

Se seleccionaron aleatoriamente sujetos mayores de edad sin diabetes provenientes del Examen de Medicina Preventivo (EMPA) y pacientes diagnosticados con diabetes mellitus tipo 2 (DB2), provenientes del Programa Cardiovascular del CESFAM Villa Alegre, Chile. Fueron distribuidos en dos grupos: Grupo DB2: 30 pacientes con historial conocido de DB2 en el último año y examen HbA1c realizado máximo 3 meses previos al examen (el valor de HbA1c fueron recolectados desde las fichas clínicas). Grupo Control: 30 pacientes sin diabetes, de acuerdo a los registros clínicos provenientes del programa EMPA. Se obtuvo el consentimiento informado de cada participante. Se excluyeron pacientes fumadores o consumidores de alcohol, con diagnóstico de anemia o cualquier otra enfermedad sistémica o aquellos bajo algún medicamento que no sea para el control de la diabetes. Los datos de identificación fueron encriptados y la custodia de esta información estuvo a cargo del Director del Departamento de Ciencias Básicas Biomédicas (IR). Se obtuvieron 2 muestras citológicas acompañadas cada una con medición de glicemia capilar, con intervalos de un 1 mes (mes número 1, primer registro; mes número 3, segundo registro). Se realizó un examen clínico odontológico a los sujetos, previo a la recolección de las muestras, para comprobar la salud de la mucosa oral de la zona donante.

Medición de glicemia capilar

Una vez lavadas las manos, desde la zona lateral de los dedos se realizó la medición matutina (8:30-11:00 a.m) de la glicemia en ayuno mediante un glucómetro (OptiumXceed, Abbott Diabetes Care Ltd. CA, USA) y tiras FreeStyleOptium (Abbott Diabetes Care Ltd., OYC, UK).

Citología exfoliativa

Los pacientes se enjuagaron con una solución de cloruro de sodio al 0,9%. Luego se secó la superficie de la mucosa con gasa estéril para remover restos superficiales y el exceso de saliva. Se tomó un frotis de mucosa de la bucca (mejilla) clínicamente normal, usando un cepillo citológico (Pap-Brush), embebido en agua destilada, de acuerdo con protocolos previos [4]. Las muestras se transfirieron sobre un portaobjeto de vidrio limpio, esparciendo el contenido uniformemente con un movimiento circular en un solo sentido y fueron fijadas con Cito-Fijador (CCG, Chile), para posteriormente ser teñidas con el método de Papanicolau.

Análisis citomorfométricos

Para la lectura citológica de las preparaciones se utilizó un microscopio óptico Trinocular Primo Star (Carl Zeiss, Gottinger, Germany). Las imágenes se obtuvieron con una cámara digital EOS Rebel XSI (Canon Inc., Japon) acoplada al microscopio y conectada a un computador para las mediciones. Se midieron 50 células claramente definidas en cada caso, utilizando el programa ImageJ 1.47v (http://imagej.nih.gov/ij/download.html) para obtener los valores del diámetro nuclear (DN), diámetro citoplasmática (DC) y la  proporción diámetro núcleo:citoplasma (RNC). Además se registró la presencia de cariorrexis (patrón de rejilla en un núcleo hipercromático)[7] y la bi-nucleación.

Análisis estadístico

Se utilizó el software SPSS 15.0 para Windows. La significancia estadística se estableció como p ≤ 0,05 para todas las pruebas. Se realizaron pruebas de normalidad con test de ShapiroWilk. Para la correlación se utilizó el coeficiente de Pearson o Spearman. Los datos cualitativos fueron comparados con el Test exacto de Fisher, y los datos cuantitativos con el Test t de Student. Para determinar la probabilidad en la predicción del diagnóstico de diabetes se utilizó una regresión logística binaria, de pasos hacia adelante (razón de verosimilitud), con el Test de Hosmet y Lemeshow para evaluar bondad de ajuste de los datos al modelo de regresión logística.

Resultados


La edad promedio para el grupo Control fue de 35 años y de 49,9 en el grupo DB2. Durante el segundo registro, existió un porcentaje de pérdida del 10% en el grupo Control y 6,67% en el grupo DB2.

Los pacientes con diabetes mellitus tipo 2 presentan mayores niveles de glicemia capilar

La Tabla 1 muestra que los niveles de glicemia capilar fueron significativamente mayores para los pacientes del grupo DB2 comparado con los del grupo Control para ambos registros (valor p<0,001, Test t de Student).

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Los pacientes con diabetes mellitus tipo 2 presentan un mayor tamaño nuclear, proporción núcleo:citoplasma y menor tamaño citoplasmático

Existió una buena concordancia entre los observadores (coeficiente kappa de 0,92, para las características cualitativas; coeficiente de Lin de 0,98, para las características cuantitativas). La Tabla 1 muestra el análisis para las características citomorfométricas y la glicemia capilar para el primer y segundo registro. El DN y la RNC fue significativamente mayor en pacientes del grupo DB2 comparada con los pacientes del grupo Control para ambos registros (primer registro DN valor p=0,006, RNC valor p=0,0025, test t de Student; segundo registro DN y RNC valor p<0,001, Test t de Student). El diámetro citoplasmático fue significativamente menor para el grupo Control comparado con el grupo DB2 solamente para el primer registro (valor p=0,01, Test t de Student).

Los cambios citomorfométricos se asociaron con los niveles de glicemia

La Tabla 2 muestra las correlaciones entre los cambios citomorfométricos, los niveles de glicemia capilar y Hb1Ac. No existe correlación entre Hb1Ac y los cambios citomorfométricos (valor p>0,05, Coeficiente de correlación de Pearson). A mayor porcentaje de Hb1Ac aumenta significativamente los niveles de glicemia existiendo una correlación lineal directa débil para la primera toma de muestras (valor p<0,001, Coeficiente de correlación de Pearson=0,611), pero no existió correlación para el segundo registro (valor p=0,139). Cuando los niveles de glicemia son mayores hay un aumento del tamaño nuclear para ambos registros, existiendo una correlación lineal directa muy débil (primer registro: valor p=0,024, coeficiente de Pearson=0,291; segundo registro, valor p=0,002 coeficiente de Pearson=0,419). La RNC aumenta cuando los niveles de glicemia capilar son mayores en el segundo registro, con una correlación lineal directa débil (valor p=0,004, Coeficiente de correlación de Pearson =0,405). No existe correlación entre el nivel de glicemia y el diámetro celular (valor p>0,05).

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La cariorrexis y binucleación se asociaron al diagnóstico de diabetes mellitus tipo2

La Tabla 3 muestra una asociación entre las variables binucleación y cariorrexis con los pacientes del grupo DB2 (valor p<0,001, Test exacto de Fisher). El 96,67% y 96,15% del grupo DB2 presentó binucleación en comparación con el grupo Control, sólo el 6,67% y 8,34% (primer y segundo registro). Para la cariorrexis los porcentajes son menores, en el grupo DB2 el 76,67% y 80,77% y para el grupo control el 6,67 y 0%, en el primer y segundo registro respectivamente.

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No es posible discriminar si un paciente presenta diabetes mellitus tipo 2 mediante los cambios citomorfométricos

Con el fin de evaluar el valor predictivo o discriminatorio del análisis citomorfométrico a partir de la citología exfoliativa se realizaron 2 modelos de regresión logística binaria, el primero (RLB1) incluyó en las variables independientes el DN, DC y RNC, para el segundo (RLB2) se eliminó la variable RNC (Tabla 4). Cuanto más alto es el valor de R-cuadrado más explicativo es el modelo, es decir, las variables independientes explican la variable dependiente, con valores entre 0 y 1. En RLB1, el valor de R-cuadrado fue de 0,273 (R-cuadrado de Nagelkerke), que indica que el 27,3% de la variación del diagnóstico es explicado por las variables incluidas en el modelo. La evaluación de bondad de ajuste muestra que el modelo no se ajusta a la realidad (valor p<0,05). RLB1 clasificó correctamente al 75% de los casos de nuestra muestra, observándose una sensibilidad de un 80% y una especificidad del 70%. El parámetro estimado (B) no mostró significancia para ninguna de las variables dentro de la ecuación.

En RLB2 se observa que el valor de R-cuadrado de 0,209 que indica que el 20,9% de la variación del diagnóstico es explicado por las variables incluidas en el modelo. La evaluación de la bondad de ajuste, muestra que el modelo se ajusta a la realidad (valor p=0,470, Test de Hosmer y Lemeshow). Mediante RLB2 se pudo clasificar correctamente al 70% de los casos de nuestra muestra, presentando una sensibilidad y especificidad  menores que el primer modelo. Al analizar las variables dentro del segundo modelo, el parámetro estimado (B) mostró significancia estadística (valor p<0,005) solamente para la variable DN y su valor positivo indica una mayor probabilidad de encontrar el diagnóstico. Exp(B) –exponencial de (B)- indica la fortaleza de la relación, cuanto más alejada de 1 está más fuerte es la relación.

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Discusión


En el presente estudio se seleccionaron pacientes con diabetes mellitus tipo 2 y pacientes sin diabetes de acuerdo a los registros clínicos de un centro de salud. A cada uno se le realizaron dos muestras de citología exfoliativa de bucca (mejilla) clínicamente sana, con intervalos de un mes, acompañado de la medición de glicemia capilar. Posteriormente, se obtuvieron registros de los tamaños nucleares, tamaño citoplasmáticos, la relación matemática entre estos, y la presencia o ausencia de cariorrexis y binucleación.

Fue sorprendente encontrar que el grupo Control presentó altos niveles de glicemia capilar, clasificándolos como prediabéticos [8], lo que puede deberse a la desviación de los valores registrados por los glucómetros [9] o bien por diferencia horaria en la toma de las muestras

La citomorfometría mostró un aumento significativamente mayor en el tamaño nuclear de los pacientes del grupo DB2 en comparación con los pacientes del grupo Control, y una mayor relación núcleo/citoplasma para ambas tomas de muestras. Estos resultados concuerdan con la evidencia disponible [2][4][10][11][12]. El tamaño citoplasmático fue significativamente menor para los pacientes del grupo DB2 en comparación con los pacientes del grupo Control en el segundo registro. Resultados que concuerdan con lo reportado por Prasad et al. [3] en pacientes diabéticos no controlados, quien además de comparar pacientes sanos y diabéticos, clasificó a estos últimos según el grado de control de la enfermedad medida a través de la Hb1Ac. Jajarm et al[10] reportaron un mayor tamaño citoplasmático en pacientes diabéticos. En múltiples estudios no se encontró diferencia significativa para el tamaño citoplasmático [2][11][12], atribuido posiblemente a que algunos investigadores registran el diámetro y otros el área citoplasmática.

La presencia de cariorrexis y binucleación fue estadísticamente mayor para el grupo diabético en contraste con el grupo sano, resultados que concuerdan con lo observados por Jajarm et al. [10] pero solamente en las muestras de bucca, y en lo observado por Ahmed & Garib [13] tanto para muestras de bucca y encía adherida. Otros autores como Alberti et al. [2] , Prasad et al. [3]  y Shareef et al. [11] describieron una mayor presencia de cambios cualitativos en pacientes diabéticos, incluyendo la cariorrexis y binucleación, sin ser incluidos test estadísticos en sus análisis. Este aumento se explica, debido a la isquemia local, la que puede llevar a cariopicnosis, cariolisis y cariorrexis, que no constituyen etapas propias de la degeneración celular, sino que aparentemente representan formas distintas de la reacción [14].

Se buscó relacionar los cambios citomorfométricos con los niveles Hb1Ac y glicemia capilar. Se encontró que no existe una correlación entre tamaño nuclear, tamaño citoplasmático y RNC con los niveles de Hb1Ac, resultados que son contradictorios en lo encontrado por Prasad et al. [3], quien observó que la severidad de la diabetes, medida por Hb1Ac, tenía relación con el aumento del tamaño nuclear y RNC. Esto se puede deber a que el estudio citado incluyó pacientes con niveles de Hb1Ac pobremente controlados, al contrario de nuestra investigación, donde existe un buen control. Sin embargo, se encontró una correlación lineal directa débil entre los niveles de glicemia con el tamaño nuclear y la RNC, en donde a mayores niveles de glicemia, mayor eran los tamaños nucleares y la RNC, resultados que concuerdan con lo descrito por Hallikerimath et al. [12] y Rivera & Nuñez-de-Mendoza [4]. En consecuencia, que los cambios citomorfométricos estén asociados a los niveles de glucosa capilar y no a la Hb1Ac nos hace pensar que esto se debe a un proceso agudo más que a uno crónico, y que éstos se vayan modificando de acuerdo a los distintos niveles de glicemia que vayan presentando los pacientes [12].

Se buscó determinar si es posible por medio de los cambios citomorfométricos predecir o discriminar si un paciente es diabético o no, ya que al entender de estos autores no existen artículos que hablen de la real utilidad diagnóstica de la citología exfoliativa hasta la fecha. Para ello se utilizaron 2 modelos de regresión logística binaria, el primero fue desechado debido a que los datos no se ajustaban a la realidad. El segundo explicó pobremente la varianza de la diabetes mellitus tipo 2 con una especificidad y sensibilidad moderada para la clasificación de los pacientes, porcentajes que no son suficientes para considerar a la citología exfoliativa apoyada con citomorfometría como una herramienta diagnóstica y de control. Además se debe tener en consideración que los cambios observados en el grupo DB2 no son exclusivos de la enfermedad, lo que limita aún más su real utilidad clínica odontológica. En conclusión, no es posible predecir y clasificar a partir de la citología exfoliativa la presencia de diabetes mellitus tipo 2.


Diagnostic utility of exfoliative cytology of oral epithelium cells in diabetes type 2. Abstract: The exfoliative cytology has previously shown changes in oral desquamated cells in patients with type 2 diabetes mellitus (DB2). The objective of this research was to determine the ability to identify the presence of DB2 from these changes. By oral exfoliative cytology diabetic patients (n = 30) and controls (n = 30) were obtained (in two registers, with one month interval) values of nucleus diameter (DN), cytoplasmic diameter (DC), nucleus: cytoplasm ratio (RNC) and presence / absence of binucleation and karyorrhexis. In addition, the values of capillary glycemia and glycated hemoglobin (HbA1c) were recorded. The DB2 group showed a statistically significant increase in the DN and RNC (p value <0.05, Student’s t test) compared with patients without diabetes. An association between DB2 and karyorrhexis and binucleation (p value <0.05, Fisher exact test) also was observed. The model of binary logistic regression, which included the DN and DC variables poorly explained variance diagnosis with moderate sensitivity and specificity for classification of patients with DB2. The cells of the oral mucosa of patients with DB2 have an increased nuclear and RNC diameter correlated with the values of glycemia, however DB2 is not classifiable from these analyses.  Keywords: diabetes mellitus type 2; cytological techniques; mouth mucosa.

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